摘要 茶氨酸是茶葉的特征氨基酸。大量研究表明,茶氨酸的含量不僅對茶葉的品質有很大的影響,而且具有促進大腦功能和神經的生長、抗腫瘤、降壓安神等功效。本文綜述了近十余年來國內外在茶氨酸的形成、積累、測定、制備及應用方面的研究進展。
關鍵詞 茶氨酸;形成;積累;測定;制備;應用
1 引言
至今為止人們在茶葉中已發現25種氨基酸。其中茶氨酸約占氨基酸總量的50%。大多數學者認為茶氨酸是茶葉的特征氨基酸,因為到目前為止除了在茶梅、山茶、油茶、簟等四種天然植物中檢測出其微量存在外,其他植物中尚未發現。茶氨酸(theanine)是1950年日本學者酒戶彌二郎首次從綠茶中分離并命名的,它屬酰胺類化合物,化學命名:Ｎ乙基Ｌ谷氨酰胺,結構式:ＨＯＣＯＣＨＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ3。自然存在的茶氨酸均為Ｌ型,純品為白色針狀結晶,熔點217～218℃(分解),比旋光度[α]20Ｄ=0 7°,極易溶于水,水解度呈微酸性,有焦糖香及類似味精的鮮爽味,研究證明它的含量與綠茶的品質密切相關,相關系數為0 787～0 876[1]。
2 茶葉中茶氨酸研究進展
作為茶葉的特征氨基酸,茶氨酸幾乎存在于茶樹的所有器官和組織中。經大量研究表明,茶氨酸在茶樹的根部形成,然后向新梢積聚,因而茶樹新梢中茶氨酸含量最高。茶氨酸的形成是茶樹儲存氮的手段之一,這是因為茶氨酸被茶氨酸水解酶水解為谷氨酸和乙胺,乙胺在胺氧化酶的作用下產生氨和乙醛,氨可作為氮源供茶樹的幼齡組織生長,因此茶氨酸是茶樹幼芽光合作用開始前有機碳骨架合成的起始物,而且也是茶樹中多酚類物質的重要前體。茶氨酸在茶樹中的積累與光照、溫度和合成前體密切相關。研究發現當溫度為25℃,黑暗條件下,在培養基中加入鹽酸乙胺能明顯增加茶氨酸的積累。1992年我國學者李榮林等對茶樹新梢中茶氨酸的分布情況及其在不同季節、不同品種和不同栽培條件下含量的變化作了較全面的研究[2]。他們發現,隨著茶樹葉片成熟度的增加,茶氨酸的含量逐漸降低,因此茶氨酸可作為茶鮮葉嫩度的化學指標之一;茶氨酸在新梢中的含量隨季節的不同存在顯著的差異,其在春茶新梢中的含量是在夏茶中的4倍,是在秋茶中的7倍;環境對茶氨酸含量也有較大的影響,土壤的ｐＨ值下降,不利于茶氨酸的積累,而氨態氮的存在和遮蔭環境有利于茶氨酸的積累; 茶葉制作過程不同,其茶中茶氨酸的含量也有明顯變化。綠茶制造過程中由于谷氨酸的轉化使茶氨酸的含量呈增加趨勢;黃茶、青茶、黑茶制造過程中谷氨酸的變化不明顯,茶氨酸呈減少趨勢;白茶制造過程中茶氨酸變化的特點是長時間的萎凋中蛋白質分解,谷氨酸增多并向茶氨酸轉化,因此茶氨酸開始表現為增加趨勢直至干燥才有所減少;而紅茶發酵過程茶氨酸變化復雜,有增有減,總趨勢是減少。雖然人們普遍認為茶氨酸可作為評價綠茶質量的重要標志之一,但對紅茶茶氨酸的含量與其品質的相關性問題有著不同的看法。
K.HelenEkborgOtt等在對17種茶的茶氨酸含量進行分析時發現, 某些紅茶中茶氨酸的含量并不比綠茶和烏龍茶低,有的紅茶 (如中國的云南茶)中茶氨酸的含量甚至還高于某些綠茶 [3]。趙和濤等在研究茶氨酸的生化特性時測定了我國六大茶類中茶氨酸的含量[4]發現以白茶中茶氨酸的含量最高,為30079mg/100g;其次是綠茶和黃茶,在17301～1944 7mg/100g之間;紅茶相對綠茶低一點,為14616mg/100g;青茶為6274mg/100g;含量最低的是黑茶,只有711mg/100g,這可能是由于其加工過程中特有的渥堆作用導致了茶氨酸大量損失。因此也有學者認為茶氨酸的含量也可作為紅茶品質的重要評價因子之一。湖南農業大學的唐和平等對9個茶樹品種及紅山茶、白山茶進行了氨基酸組成的分析[5],并比較了其中茶氨酸含量的差異,他們發現山茶中雖有茶氨酸存在,但含量甚微;通過對不同進化層次的茶樹品種進行茶氨酸含量分析,證明茶氨酸含量隨茶樹進化層次的提高呈積累趨勢,并以山茶中也發現茶氨酸說明茶與山茶存在一定的親緣關系,由此支持茶樹應屬山茶屬的觀點。1997年齊貴年等比較了經蒸汽殺青、鍋炒殺青和滾筒殺青的扁形特種綠茶氨基酸含量的變化[6],結果表明,不同工藝殺青對氨基酸組分含量有一定的影響,其氨基酸總量和茶氨酸含量均為蒸汽殺青>鍋炒殺青>滾筒殺青,并且提出可通過工藝技術對茶葉中茶氨酸和其他氨基酸的含量進行調控。同年鐘俊輝等研究了不同培養條件、不同碳源和不同環境對茶愈傷組織培養及其茶氨酸的積累的影響[7],發現激素ＩＡＡ和6 ＢＡ結合作用時,以ＩＡＡ2mg/Ｌ和6 ＢＡ4mg/Ｌ時對茶氨酸積累最有利;而培養基中碳源不同,愈傷組織的增長速率及其茶氨酸的含量的差異并不顯著,但當用不同濃度的蔗糖作為碳源時發現,隨著蔗糖濃度的增加茶氨酸的積累呈上升趨勢。與其他文獻相同,他們的研究結果表明25℃、黑暗條件有利于茶氨酸的積累。
3 茶氨酸的測定與制備茶氨酸的分析方法有多種,有傳統的陰離子交換樹脂層析法、薄層色譜法、氣相色譜法[8,9]等。近十多年來隨著高效液相色譜技術的迅猛發展,分析速度、靈敏度和自動化程度的不斷提高,該技術越來越廣泛地應用于氨基酸分析領域。因大多數氨基酸無紫外吸收和熒光發射特性,標準折射探測儀對氨基酸檢測也無足夠的靈敏度,所以為提高分析檢測靈敏度和分離選擇特性,通常將其衍生。二十世紀八十年代中期美國Ｗａｔｅｒｓ公司率先推出了氨基酸自動分析系統及技術[10],他們采用異氰酸苯酯(ＰＩＴＣ)作為衍生試劑,柱前衍生,反相色譜分離的原理,用紫外檢測進行氨基酸分析。隨后,惠普公司推出了ＨＰＡｍｉｎｏＱｕａｎｔ氨基酸分析系統及技術[11],采用鄰苯二甲醛(ＯＰＡ)和氯甲酸芴甲酯(ＦＭＯＣ)作為衍生試劑,既可用紫外又可用熒光進行檢測。董泗建等對幾種柱前衍生的氨基酸分析法的色譜條件進行了改進[12],在降低成本的基礎上進一步優化了分離效果。1994年Ｗａｔｅｒｓ公司又推出了一套全新的氨基酸分析技術,他們采用6 氨基喹啉 Ｎ 羥基琥珀酰亞胺基 氨基甲酸酯(ＡＱＣ)作為衍生試劑,以乙腈和水作為流動相,梯度洗脫,紫外或熒光檢測器檢測,該法簡稱為ＡＣＣＱ ＴＡＧ法。在日本學者莽也邦夫等采用高效液相色譜法測定了茶葉中茶氨酸含量之后,我國學者郭升平對用高效液相色譜測定茶葉中茶氨酸進行了較詳細的研究[13],他采用ＷａｔｅｒｓＭ344高效液相色譜儀,以ＰＩＴＣ柱前衍生,反相Ｃ18柱分離(Ｗａｔｅｒｓ的Ｐｉｃｏ ＴａｇＴＭＨＡＡ柱),柱溫43℃,梯度洗脫,用Ｍ990二極管陣列檢測器,在ＵＶ243ｎｍ檢測。在研究中他對用乙酸乙酯提取、用80%乙醇回流3ｈ提取和經鹽酸水解等前處理的方法進行了比較,發現茶氨酸不能以酸水解方式提取,否則茶氨酸會分解成谷氨酸,而使測定結果偏低。隨著近年來分析技術和分析手段的不斷提高,毛細管電泳技術和液質聯用技術也應用到了茶氨酸檢測領域。ＫｉｅｈｎｅＡ等報道了采用熱噴霧液質聯用儀分析茶葉中多酚類物質的方法[14],他們通過測定其準分子離子峰同時測定了茶葉中的兒茶素、黃酮醇糖甙、黃酮糖甙及咖啡因、可可堿和茶氨酸。ＡｕｃａｍｐＪＰ等則研究了用毛細管電泳儀同時進行兒茶素、茶氨酸、咖啡因及沒食子酸、抗壞血酸分析的方法[15]。
目前,高純度的茶氨酸主要通過細胞組培、化學合成、微生物發酵和離子交換樹脂分離等方式獲取。人們用14Ｃ示蹤的方法早已證實了茶樹中茶氨酸合成前體是谷氨酸和乙胺。一般認為當培養基中乙胺的濃度為25ｍＭ時,茶葉愈傷組織的茶氨酸的生物合成為最大值。1998年陳瑛等研究了多種激素對茶愈傷組織合成茶氨酸的影響[16],他們對生長素(ＩＡＡ)、萘乙酸(ＮＡＡ)、吲哚丁酸(ＩＢＡ)、2,4 二氯苯氧乙酸(2,4 Ｄ)、6 芐基腺嘌呤(6 ＢＡ)、玉米素(ＺＴ)、激動素(ＫＴ)、和三十烷醇(ＴＡ)的不同濃度、不同配比進行試驗,得出了茶愈傷組織生長和茶氨酸積累的較佳培養條件。除了利用細胞組織培養茶氨酸之外,化學合成也是得到高純度茶氨酸的有效方法[17]。采用化學合成手段制造氨基酸始于二十世紀五十年代,它具有價格低,成本低,適合工業化生產的特點。但是化學合成制造的都是ＤＬ 型消旋體,需要進行拆分才能得到Ｌ 型產品。日本學者在這方面作了大量的工作,他們采用微生物固化酶分離ＤＬ 型氨基酸取得了成功。采用微生物發酵法可直接得到Ｌ 型氨基酸,但反應時間較長,設備規模較龐大,副產物也較多,需要進一步分離精制,成本相對較高。因此建立在化學合成法和微生物發酵法基礎上的酶轉化法或稱酶工程技術應運而生了。這種技術是應用特定酶的催化作用,使某些化合物轉化成相應的Ｌ 氨基酸。ＨｉｄｅｙｕｋｉＳｕｚｕｋｉ等報道了他們把這一技術應用到茶氨酸的制備中的最新研究成果[18],他們利用從細菌中得到的谷氨酰轉肽酶作催化劑,將200ｍＭ谷氨酸和1 5Ｍ乙胺在ｐＨ為10,溫度為37℃的條件下,保持2小時,獲得120ｍＭ茶氨酸,轉化率為60%。茶氨酸作為兩性物質,選擇適當的ｐＨ值,用離子交換樹脂分離提取也是一種有效的手段,但這方面的報道并不多見。1998年陳瑛等報道了用離子交換法提取茶氨酸的研究結果[19],他們選用國產732陽離子交換樹脂,從茶愈傷組織浸提液中提取茶氨酸,并討論了洗脫液離子強度和ｐＨ值對樹脂吸附茶氨酸的影響,以及上樣濃度、洗脫速度對樹脂交換過程的影響。
